Método de investigación xenética molecular

Para explorar e identificar variantes de estrutura do ADN método de xenética molecular utilizadas. Para cada Regi de ADN, que explota esta rexión do cromosoma, un xene ou alelo, os métodos difiren. Subxacente a cada método de xenética molecular comprende algúns ou outra manipulación de ARN e ADN. Todos estes métodos son caracterizados por unha enorme complexidade, sen condicións de laboratorio non pode ser levada a cabo, e os funcionarios deben ser altamente cualificados. Este traballo se realiza en varias etapas.

etapas

En primeiro lugar, mostras de ARN ou ADN a ser producida. Aquí, un método de xenética molecular pode ser aplicado a case calquera material: unha pinga de sangue, leucocitos, fibroblastos de cultura, mucosa (raspar), mesmo os folículos de pelo, - O ADN pode ser obtido a partir de calquera mostra. É axeitado usar os métodos de xenética molecular e as súas varias opcións e ter illado o ADN de lonxitude é almacenado conxelado. A segunda fase está dedicada á acumulación dos fragmentos desexados (amplificación de ADN), xa que axuda a asegurar a reacción en cadea de polimerase in vitro (in vitro sen compromiso do organismo vivo). Como un resultado, os fragmentos de ADN seleccionados multiplica por esta reacción en cadea, ea cantidade de ADN aumenta literalmente millóns de veces.

O terceiro paso dos métodos de investigación xenética molecular é asumido restrición multiplicado ADN (esta fragmentación, rasgar ou corte). Restrición realizada por electroforese sobre un xel de poliacrilamida é de agarose. Este método de xenética molecular, de estudar o fragmento de ADN permite a todos a tomar unha determinada posición no xel. A continuación, o xel é tratado con bromuro de etídio, capaces de se ligaren ao ADN, a irradiación con luz ultravioleta, é posíbel observar porcións de luminecencia. métodos diagnósticos xenéticos moleculares son variadas e numerosas, pero os dous primeiros pasos son comúns a todos. Pero a fin de identificar fragmentos de ADN, o xel pode ser colorido, e moitos outros métodos existentes.

especies

Os métodos máis directos e difundidos para detectar micobactérias poden incluír o método molecular superior a aprendizaxe ADN xenético. A súa esencia é que, para identificar o material de corrente de varrido de fragmentos específicos de ADN de axentes patóxenos. técnicas de diagnóstico xenéticos moleculares aínda non teñen unha forma máis eficiente para recoñecer tales enfermidades como a tuberculose. Utilizando a reacción en cadea da polimerase (PCR), pode estar seguro de que o ADN orixinal será aumentar o número de copias dun millón de veces, isto é, haberá amplificación, e que pode amosar os resultados. O nivel de sensibilidade é moi alta - máis de noventa e cinco por cento, o que é a principal vantaxe deste método.

O resto dos métodos da xenética molecular, de investigación sobre a eficacia de rendemento múltiples copias literalmente dobrado, xa que neste caso a mostra de elaboración mostra unha secuencia oligonucleotídica específica aumentou a cento e seis veces. Mesmo o diagnóstico de tuberculose cultura do sistema respiratorio inferior significativamente a súa sensibilidade. É por iso que a medicina moderna baséase en métodos de xenética molecular de diagnóstico de tuberculose. Un método descrito é eficaz, especialmente cando se trata sobre patógenos de alta variabilidade antigênica, determinar que outra forma é moito máis difícil - require especiais medios nutritivos e cultivar longo tempo. métodos de xenética molecular e bioquímica producir efecto moi diferente sobre os resultados.

diagnóstico de tuberculose

Marshall diagnóstico por PCR de tuberculose máis vulgarmente usando aquelas secuencias de ADN que son específicos para todos os catro tipos de enfermidade. Para acadar este obxectivo, a miúdo utilizar iniciadores que detectan secuencia elementos IS (IS-986, IS-6110), xa que estes elementos caracterizar especies altamente migratorias Mycobacterium tuberculosis e sempre presentes múltiples copias no xenoma. Tamén a extracción do ADN pode ser realizada a partir de cultivos puras e clínica (expectoración de pacientes) por calquera outro método adecuado. Por exemplo, non hai método de lanza, onde o tapón de lise é utilizado con base no tiocianato de guanidina e sílice como ADN transportista. O número de pacientes que difiren pobre bacteriológica aumentando cada ano e, polo tanto, na práctica clínica estableceu un nivel totalmente distinto de organización: método da xenética molecular, de estudar ADN está a desempeñar un papel importante no diagnóstico.

Con todo, debemos admitir que non é sen inconvenientes. O método PCR é o uso de moitas veces trae un gran número de resultados falso-positivos, ea razón é non só erros técnicos, pero tamén as características do propio método. Ademais, o uso deste método de diagnóstico para determinar a viabilidade de micobactérias, que foron identificados, é simplemente imposible. Pero esta desvantaxe non é o máis importante. métodos de xenética molecular de diagnóstico de PCR implica o risco de contaminación de ADN micobacteriano. requisitos de certificación para esta razón que, para laboratorios de PCR deseñado exclusivamente duro, eles esixen tres instalacións separadas. tecnoloxía de PCR é moderno e moi complexa, que esixe o uso de equipamento adecuado e persoal altamente adestrado.

bacterioscopia

Cando os resultados do diagnóstico das análises deben ser comparados con outros datos: exame clínico, radiografía, baciloscopia, cultura e mesmo resposta a un tratamento específico, moi importante. Nesta serie, os estudos de PCR é só un dos compoñentes. Detectar o patóxeno no diagnóstico precoz pode ser os métodos máis sinxelo e rápido - bacteriolóxicos.

Non se emprega un microscopio de luz (cor de Ziehl-Neelsen) e fluorescentes (colorantes fluorocromos). A vantaxe é a velocidade esfregaço os resultados. Pero a súa desvantaxe é xustamente considerado a capacidade limitada debido á baixa sensibilidade. Sen embargo, este método é dado recomendación da OMS como o máis económico e do solo para detectar pacientes con tuberculose. Detección de micobactérias método bacteriológico ten o valor de predición e da excreción bacteriana cuantitativamente estimada. Máis confiado para tratar con el métodos de investigación de xenética molecular da tuberculose.

culturas

Mellor detección de micobactérias recoñecer estudos culturais. Sementeira material patolóxico que está feito para o medio de ovo: Mordovsky, Finn II, LJ, e semellantes. Benchmarks de resistencia de micobactérias a medicamentos e evidencias indirectas da eficacia dun número de micobactérias e as súas colonias in vitro, o método aplicado de cultura de busca. Para aumentar a porcentaxe de illamento de inoculação micobactérias de material patolóxico realízase en varios ambientes.

Satisfacer as necesidades dos numerosos, patóxeno incluíndo concesión e fluídos cultural. Ocasión neste sistema e automatizado tipo de medida crecemento VANTES. Culturas deben ser sometido á incubación por ata sete a oito semanas. Por esta altura a cultura coa falta de crecemento pode considerarse negativo. O xeito máis eficaz para a detección de Mycobacterium tuberculosis considerar mostras biolóxicas: cobaias material de infectar de diagnóstico, que son moi sensibles á tuberculose.

algúns números

interesante campo de estudo, o que foi aberto polo diagnóstico de PCR foi o de estudar a M. tuberculosis - a infección latente. O concepto moderno de infección por tuberculose suxire que en cada cen persoas que estaban en contacto con M. tuberculosis, noventa e pode moi ben ser infectados, pero só dez deles son enfermidade activa está a ser desenvolvido. Outros teñen inmunidade TB, e porque noventa por cento dos casos, a infección segue latente. Detectar un patrón que axudou a un método de xenética molecular.

Xenetistas dicir que cincuenta e cinco por cento das persoas cuxas culturas patolóxico materiais foron negativos, oitenta por cento das persoas infectadas M. tuberculosis, pero que flúe sen manifestacións radiográficas da enfermidade, as respostas de PCR positivos recibido. É un método de diagnóstico xenético axudaron a identificar os pacientes en risco por estudos de PCR, cos resultados das súas análises (microscopia e cultura) foron negativas, e infección subclínica M. tuberculosis estaba presente.

investigación moderna

A Federación Rusa e laboratorios bacteriolóxicos usar un método acelerado de concentracións absolutas: actividade de redutase do nitrato de micobactérias ensaiados por reactivo de Griess. centros anti-TB utilizar un método que permite determinar a resistencia aos medicamentos. Esta sementeira en medio líquido, onde automatizado radiométrica e sistema de contabilidade fluorescente crecemento de micobactérias. Tal análise está feita rapidamente - ata dúas semanas.

Na actualidade, os novos métodos están sendo desenvolvidos: resistencia a drogas de micobactérias mídese ao nivel do genótipo. Estudo dos mecanismos moleculares dos xenes de resistencia e mostra a presenza micobactérias. Estes xenes están asociados a resistencia a certos medicamentos. Por exemplo, os xenes Kasa, Inha, KatG resistente á isoniazida, xene rpoB - xenes rifampicina ARN 16Sp e rpsL - estreptomicina, emb1 - a etambutol, gyrA - unha fluoroquinolona e así por diante.

mutacións

O diagnóstico moderno aumentou significativamente o método nivel da xenética molecular, para o estudo de ADN e deixou-se realizar estudos a gran escala de mutacións en todo o seu espectro. Agora sabemos que as mutacións máis comúns nos 516, 526 e 531 códons do xene rpoB, e identificou a resistencia a varias drogas. Hai unha serie de métodos para a tipagem de micobactérias, utilizando non só os métodos tradicionais - bioquímicos, biolóxicos e culturais, pero tamén amplamente utilizadas técnicas de xenética molecular moderna. Xa non son adecuados e proporcionar o método de diagnóstico correcto para a detección de enfermidades monogénicas. Eles baséanse en estudos de ADN na rexión exacta dun determinado xene. Isto xeralmente é un proceso complexo, lento e caro, pero os datos que son proporcionados pola análise xenética molecular, é moito máis preciso e informativo que os datos de todas as outras análises.

El foi coñecido que o ADN non cambia para toda a vida do organismo que é en calquera células odnakova nucleadas, e iso fai que sexa posible tomar a análise de absolutamente todas as células do corpo, en calquera fase da ontoxenia. O xene danado pode ser detectado antes da aparición dos primeiros síntomas da enfermidade clínica en grande escala, así como en persoas sas heterozigóticas, pero cunha mutación no xene. métodos de diagnóstico da enfermidade hereditaria xenética molecular permiten desvelar as súas (visión directa, de ADN para diagnóstico), así como para analizar a segregación da enfermidade na familia con ADN marcador loci (polimorfismos xenéticos), que están intimamente ligados cun xene danado (é dicir, o enfoque indirecta de ADN para diagnóstico). Directa ou indirectamente - calquera diagnóstico de ADN baséase nos métodos de identificación dunha porción rigorosamente definidos do ADN humano.

métodos directos

Os métodos directos de diagnóstico de ADN son cando a enfermidade hereditaria xene culpable é coñecido como ben coñecido, e os seus tipos de mutacións. Por exemplo, un adecuado métodos directos nun número de enfermidades. Este Corea de Huntington (extensión CTG-unidades de repetición), fenilcetonúria (R408W), a fibrose cística (delF508, as principais mutacións) e similares. A principal vantaxe do método directo é unha precisión de diagnóstico totalmente detida, e non hai necesidade de se facer unha análise de ADN do resto da familia. Se unha mutación no xene correspondente se atopa, que permite exactamente aprobar un diagnóstico de herdanza, determinación do genótipo para o resto da familia sobrecarregados.

Outra vantaxe do diagnóstico directo considérase para identificar un portador heterozigoto de malos mutacións de familiares e pais que morreron de enfermidade. Isto é especialmente certo para enfermidades autossômica recesiva. Desvantaxes dos métodos directos tamén están dispoñibles. Para aplicala los, ten que saber exactamente localizar o xene anormal, estrutura de ex intr do seu espectro e as súas mutacións. Non todas as enfermidades monogênicas hoxe recibir tales información. métodos directos informatividade non pode ser considerada completa, porque un eo mesmo xene pode ter un gran número de mutación patológica que fai que o desenvolvemento de enfermidades hereditarias.

métodos indirectos

Os métodos indirectos en diagnósticos de ADN son usados en todo, noutros casos, se o xene danado non é identificada, pero só cromossomicamente, ou se o diagnóstico de liña non deu o resultado (isto ocorre, a organización molecular complexo xene ou en gran medida, se hai unha morea mutacións patológicas). Os métodos indirectos realizada a análise da segregación de marcadores polimórficos na familia alélica. Marcadores atopados na mesma rexión cromosómica ou locus é estreitamente ligada á enfermidade e representan insercións, borrados ou substitucións puntuais, repeticións, eo seu polimorfismo é debido á cantidade diferente de células no bloque.

Máis cómodo para o diagnóstico considerado microssatélites e minissatélite polimorfismos indirectos, que son amplamente distribuídos no xenoma humano. o seu valor, expresado en alto contido de información, en caso de danos para a distancia xenética entre o marcador eo xene non é moi grande. Neste último caso, a precisión da estimación é determinado en gran medida a frecuencia de recombinación entre o marcador polimórfico e danos. métodos de diagnóstico indirectos tamén proporcionar paso preliminar obrigatoria de frecuencias alélicas do estudo poboación analizada entre enfermos e portadores de mutacións, ademais da necesidade de determinar a probabilidade de recombinación de marcadores de non equilibrio e de adhesión e os alelos mutantes.

outros métodos

pequenos segmentos de ADN ou ARN, así como dun único xene visualizadas baixo estudo microscópico non pode ser, polo tanto, para identificar mutacións necesarias por diagnóstico xenética molecular. Hai un "Proxecto Xenoma Humano", así como outros avances en xenética molecular expandido enormemente a posibilidade do diagnóstico de enfermidades hereditarias - ambos pre e post-natal. Estes métodos poden proporcionar a detección precoz e facer un poli- previsión e enfermidades monogênicas, cuxa estrea ocorre na idade adulta. Por desgraza, debido ás capacidades técnicas de estudos de xenética molecular son, ás veces máis alá éticos que son definidas en relación á herdanza, especialmente cando o diagnóstico é na adolescencia e infancia.

anormalidades cromosómicas estruturais e numéricas son as causas máis comúns da enfermidade e cancro, e moitas malformacións. aberracións cromosómicas precisan ser identificados, o que é importante para asesoramento familiar - para avaliar a previsión, xunto con risco reprodutivo en embarazos futuras. análise cromosómica é o "patrón ouro" do diagnóstico xenético, pero é limitado. Só os métodos de análise xenética molecular pode facer máis, porque non hai utilizado clonación marcadores fluorescentes tecnoloxía baseada capaces de súa alta sensibilidade para identificar alteracións cromosómicas sutís que son imposibles de detectar clásicos estudos citogenéticos. Estas técnicas son cada vez máis mellore nosas capacidades de diagnóstico, cando examinados, os nenos con deficiencias de desenvolvemento, atraso mental, con moitas outras enfermidades hereditarias.

resultados

É moi importante para a humanidade foron a estrutura do xene ea función do coñecemento, tipos de variabilidade, a capacidade de detectar enfermidades hereditarias ocorridos en conexión co desenvolvemento da xenética molecular. seus métodos destínanse ao estudo da molula de ADN - e cando é normal, e cando é mal. Preparación de secuencias de ácido desoxirribonucleico de nucleótidos (ADN) esténdese en fases a partir da recepción de mostras para identificar os fragmentos individuais. Illamento de ADN xenómico a partir das células, restrición (rasgando), amplificación (clonación), electroforese dos fragmentos (que separa a súa carga eltrica eo peso molecular por xel de agarose). Identificación de fragmentos específicos situados na superficie dunha franxa discreta.

Logo metendo os filtros especiais acto, a través da cal pasa cada fragmento hibridación con fragmentos de ADN clonados ou sintéticos sondas radioactivas é un control, que pode ser igual a cada mostra de proba. Se cambiar a posición ou lonxitude en comparación coa sonda, un novo fragmento ou desapareceu - todo isto suxire que o xene analizado foi sometido a reestruturación na secuencia de nucleótidos. Hai oito técnicas básicas de estudos xenéticos moleculares: secuenciación (determinación da secuencia de ADN), reacción en cadea da polimerase (aumento do número de secuencias), a preparación de iniciadores coñecidos xenes, clonación de ADN, produción de moléculas recombinantes derivadas de proteínas debido a moléculas recombinantes, a creación dun conxunto completo (recollida biblioteca) fragmentos que foron obtidos a través do uso de restrición clonado.