Microscopía de fluorescencia: principios do método

Absorción e re-emisión de luz máis fluídos orgánicos e inorgánicos é o resultado fosforescencia ou fluorescencia. A diferenza entre a fenómenos é a duración do intervalo de tempo entre a absorción e emisión de fluxo luminoso. Cando a fluorescencia destes procesos ocorren case ao mesmo tempo, mentres fosforescencia - con algún atraso.

informacións históricas

En 1852, o científico británico Stokes, descrita por primeira vez fluorescencia. El introduciu un novo termo, como resultado dos experimentos con fluorita, que emiten luz vermella baixo luz ultravioleta. Stokes notou un fenómeno interesante. Verificouse que a lonxitude de onda da radiación fluorescente é sempre maior que o fluxo de luz de excitación.

Para confirmar a hipótese, o século 19 houbo moitos experimentos. Eles demostraron que unha variedade de mostras de fluorescencia baixo a influencia de luz ultravioleta. Entre os materiais, entre outras cousas, foi cristais, resinas, minerais, clorofila, fármacos en bruto, compostos inorgánicos, vitaminas, aceites. O uso directo de colorantes para probas biolóxicos só comezou en 1930

Microscopía de fluorescencia: Descrición

Algúns dos materiais utilizados na primeira metade dos estudos do século 20 exhibiu especificidade elevada. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Grazas ao rendemento, o que non pode ser alcanzado por medio de métodos de contraste, o método de microscopia de fluorescencia tornouse unha ferramenta esencial na investigación biomédica e biolóxica. Igualmente importantes resultados obtidos, e para materiais.

? Que vantaxes método de microscopia de fluorescencia? Utilizando novos materiais tornouse posíbel ea selección dos compoñentes submicroscópicas móbiles altamente específico. A microscopia de fluorescencia poden detectar moléculas individuais. Unha variedade de colorantes permitir a identificación de varios elementos dunha vez. A pesar da resolución espacial limitado do límite de difracción do equipo, o cal, á súa vez, depende das propiedades específicas da mostra, a identificación de moléculas por baixo deste nivel tamén é moi posible. Varias mostras tras irradiación autofluorescência exposición. Este fenómeno é amplamente utilizado en petrologia, botánica, a industria de semicondutores.

características

Estudar tecidos animais ou patógenos, moitas veces complicadas ou moi febles ou moi fortes autofluorescência inespecífica. Con todo, o valor en estudos adquire introdución, nas compoñentes de material excitada a unha lonxitude de onda específico e emitindo a intensidade do fluxo de luz necesaria. Fluorocromos actuar como colorantes capaces de, independentemente, ligados a estruturas (visibles ou invisibles). Así, eles teñen unha selectividade elevada para o branco, eo rendemento cuántico.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Microscopía de fluorescencia foi amplamente utilizado desde a chegada de colorantes naturais e sintéticos. Eles posuían certos perfís de intensidade de emisión e de excitación e dirixida obxectivos biolóxicos específicos.

Identificación de moléculas individuais

Moitas veces, en condicións ideais, pode rexistrar un elemento de brillo separado. Para iso, entre outras cousas, é necesario proporcionar unha suficientemente baixo ruído do detector eo fondo óptico. molécula de fluoresceína ao fracaso debido á fotodegradación pode emitir ata 300 mil. Os fotóns. Ao 20% de eficiencia de recollida do proceso e poden rexistrar-los nunha cantidade de preto de 60 mil.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. A microscopia de fluorescencia en base a fotodiodos de avalancha ou multiplicación electrónica, permitiu aos investigadores para observar o comportamento das moléculas individuais a través da segunda, e nalgúns casos mesmo minutos.

complexidade

A cuestión clave a favor da supresión de ruído de fondo óptico. Debido ao feito de que moitos dos materiais utilizados no proxecto de filtros e lentes exhiben algún autofluorescência, os esforzos dos científicos nas fases iniciais foron orientados a produción de compoñentes cunha fluorescencia baixo. Con todo, experimentos posteriores levaron a novas conclusións. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. En particular, verificouse que a microscopia de fluorescencia, baseado reflexión interna total, permite alcanzar un fondo baixo ea luz de excitación de alta intensidade.

mecanismo

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Os principios da microscopia de fluorescencia, con base na reflexión interna total é o uso de onda evanescente ou evanescente. Ocorre na fronteira entre medios con diferentes índices de refracción. Neste caso, o feixe de luz pasa a través do prisma. Ten un parámetro alto índice de refracción.

O prisma adxacente á solución acuosa ou de vidro con baixo parámetros. Un feixe de luz dirixido para el nun ángulo que é máis crítica, o feixe é totalmente reflectido a partir da interface. Este fenómeno, á súa vez, fai que as ondas nonpropagating. Noutras palabras, o campo electromagnético xerado que penetra nunha forma cun parámetro índice de refracción inferior a unha distancia inferior a 200 nanómetros.

A onda evanescente intensidade da luz sería suficiente para excitar fluoróforos. Con todo, por mor da súa moi pequena profundidade, o seu volume será moi pequeno. O resultado é un fondo de baixo nivel.

modificación

Microscopía de fluorescencia baseada na reflexión interna total, pode ser aplicado con epi-iluminación. Isto require lentes con elevada apertura numérica (polo menos 1,4, pero é desexable que alcanzou 1,45-1,6), e parcialmente iluminada aparello campo. O último é conseguir cun pequeno tamaño do punto. Para unha maior uniformidade mediante un fino anel, que está bloqueado por unha porción do fluxo. Para o ángulo crítico, tras o cal hai unha reflexión total, é necesario un alto nivel de refracción do medio de inmersión na lente ea tapa de vidro do microscopio.